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TYPES OF PCR MACHINES In addition to the standard methods of PCR, several modifications have been developed. By altering how PCR machines operate, they can now be used for a wider variety of applications. Some of the most common types of PCR are: 1. Conventional PCR machine The conventional polymerase chain reaction is used to amplify a target DNA sequence to several million in a short amount of time, usually in just 2-3 hours. It allows the replication of cellular genetic material using a polymerase enzyme to construct specific fragments of DNA. The polymerase enzyme works alongside a primer which is connected to a strand of DNA, allowing for the synthesis of specific parts of the DNA strand. The result of using primers in this way is the amplification of a chosen DNA sequence, up to millions or billions of copies. Conventional PCR is used in many areas of study, including medical and diagnostic research, forensic studies and research, selective DNA isolation, amplification and quantification of DNA. | TIPOS DE MÁQUINAS PCR Se han desarrollado varias modificaciones a partir de los métodos estándar de PCR. Al modificar el funcionamiento de las máquinas de PCR, se las puede emplear para una mayor variedad de aplicaciones. Entre los tipos de PCR más comunes destacan: 1. Máquina de PCR convencional La reacción en cadena de la polimerasa convencional se usa para amplificar una secuencia diana de ADN hasta varios millones en poco tiempo, normalmente en apenas 2-3 horas. Permite replicar el material genético celular utilizando una enzima polimerasa para construir fragmentos específicos de ADN. La enzima polimerasa trabaja junto a un cebador que se conecta a una cadena de ADN, permitiendo la síntesis de partes específicas de esta cadena. El resultado de este uso de los cebadores es la amplificación de una secuencia de ADN elegida, hasta millones o miles de millones de copias. La PCR convencional se utiliza en muchas áreas de estudio, como la investigación médica y de diagnóstico, los estudios e investigaciones forenses, el aislamiento selectivo del ADN, o la amplificación y cuantificación del ADN. | ||
2. qPCR Quantitative PCR (qPCR), also called real-time PCR, or RT-PCR, is a variation of the standard polymerase chain reaction which uses just one machine to combine the amplification of a target DNA sequence with the quantification of the concentration of the DNA in any given reaction. This is done using fluorescence-detecting thermocyclers. Compared to conventional PCR, qPCR provides a faster alternative to facilitate analysis by detecting products in real-time during the exponential phase. Fluorescent dyes signal DNA of interest, and the amount of fluorescence generated is determined by the quantity of DNA present. There are various models of real-time PCR available, but they all have common features: a standard thermal cycler platform coupled with an excitation source (usually a laser or tungsten lamp), a camera for fluorescence detection, and computer and software for data processing. qPCR can be used in genotyping and quantification of pathogens, microRNA analysis, cancer detection, microbial load testing and GMOs detection. | 2. qPCR La PCR cuantitativa (qPCR), también llamada PCR en tiempo real o RT-PCR, es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa estándar que utiliza una sola máquina para combinar la amplificación de una secuencia objetivo de ADN con la cuantificación de la concentración del ADN en una reacción determinada. Para esto se emplean termocicladores con detección fluorescente. En comparación con la PCR convencional, la qPCR ofrece una alternativa más rápida que facilita el análisis porque detecta los productos en tiempo real durante la fase exponencial. Los tintes fluorescentes marcan el ADN de interés, de forma que la cantidad de fluorescencia generada está en correlación con la cantidad de ADN presente. Existen varios modelos de PCR en tiempo real, pero todos comparten sus principales características: un termociclador estándar acoplado a una fuente de excitación (normalmente un láser o una lámpara de tungsteno), una cámara para la detección de la fluorescencia, y un ordenador y un software para procesar los datos. La qPCR puede emplearse para el genotipado y la cuantificación de patógenos, el análisis de microARN, la detección del cáncer, las pruebas de carga microbiana, y la detección de OMGs. | ||
3. Reverse Transcription Reverse Transcription PCR (RT-PCR) is a variant on conventional polymerase chain reaction which amplifies target RNA. The addition of reverse transcriptase (RT) enzyme before PCR means it is possible to amplify and detect RNA targets. During RT-PCR, RNA molecules are converted into complementary DNA (cDNA). Single-stranded cDNA is converted into double-stranded DNA using DNA polymerase. The resulting DNA molecules can then be used and amplified in a PCR reaction. RT-PCR is used in gene insertion, research methods, genetic disease diagnosis and cancer detection. | 3. Transcripción inversa La PCR de transcripción inversa (RT-PCR) es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa convencional que amplifica el ARN objetivo. La adición de la enzima transcriptasa inversa (RT) antes de la PCR permite amplificar y detectar los ARNs objetivo. Durante la RT-PCR, las moléculas de ARN se convierten en ADN complementario (ADNc). El ADNc monocatenario se convierte en ADN bicatenario mediante el uso de la ADN polimerasa. Entonces, las moléculas de ADN resultantes pueden usarse y amplificarse en una reacción de PCR. La RT-PCR se utiliza para la inserción de genes, los métodos de análisis, el diagnóstico de enfermedades genéticas y la detección de cáncer. | ||
4. Nested Nested PCR is a modification of PCR where non-specific binding is prevented to increase the sensitivity and specificity of the reaction. Nested PCR works by having the first set of primer bind to the outside of the target DNA and amplifies a larger fragment, while a second set of primer binds specifically at the target site in successive PCR reactions. Nested PCR is great for use in phylogenetic studies and in the detection of different pathogens. This is due to the higher sensitivity brought by Nested PCR compared to conventional PCR. Even if a sample contains lower DNA, Nested PCR allows this sample to be amplified. | 4. Anidada La PCR anidada es una variante de la PCR donde se evita la unión no específica para aumentar la sensibilidad y especificidad de la reacción. La PCR anidada funciona haciendo que un primer juego de cebadores se una al exterior del ADN objetivo y amplifique un fragmento mayor, mientras que un segundo juego de cebadores se une de forma específica al lugar objetivo en las reacciones de PCR sucesivas. La PCR anidada es ideal para los estudios filogenéticos y la detección de diversos patógenos. Esto responde a la mayor sensibilidad que aporta la PCR anidada en comparación con una PCR convencional. Incluso si una muestra contiene menos ADN, la PCR anidada permite amplificarla. | ||
5. Hot Start Hot start PCR is a new form of the conventional polymerase chain reaction which reduces the occurrence of undesired products and formation of primer-dimers due to non-specific DNA amplification at room temperatures. This works by keeping the different elements of the reaction separate until the mixture reaches the denaturation temperature after heating. Hot start PCR can often increase product yields in comparison to conventional PCR. It also requires less effort than conventional PCR and reduces the risk of contamination. | 5. Arranque en caliente La PCR de arranque en caliente es una nueva forma de reacción en cadena de la polimerasa convencional que reduce la aparición de productos no deseados y la formación de dímeros de cebadores debido a la amplificación no específica del ADN a temperatura ambiente. Funciona manteniendo separados los distintos elementos de la reacción hasta que la mezcla alcanza una temperatura de desnaturalización tras calentarla. Con frecuencia, la PCR de arranque en caliente puede aumentar la obtención de productos en comparación con la PCR convencional. También requiere menos esfuerzo que la PCR convencional, y reduce los riesgos de contaminación. | ||
6. Digital (dPCR) Digital PCR devices, or dPCR, are the most accurate devices on the market. They provide absolute counts of target DNA with enhanced increased sensitivity, precision, and reproducibility. Digital polymerase chain reaction is poised to disrupt molecular analysis technology on every level. There are two types of dPCR machines: Droplet Digital PCR (ddPCR): ddPCR uses Taq polymerase to amplify targeted DNA in a complex sample. To simplify the processing, ddPCR emulsifies samples in oil and uses fluorescence to process and analyze the results. Before analysis, the sample is divided into droplets and thermocycled, then run through a 96 well PCR plate. This separation process is the primary difference between ddPCR and qPCR qdPCR: The qdPCR process is based on integrated fluidic circuits (chips). While chip-based techniques have a narrower dynamic range, they provide extremely precise sample partitioning and vastly lower variance. On the forefront of detection technology, ddPCR and qdPCR are top-of-the-line processing machines with a high price tag to match. Fortunately, it’s cheaper to lease. | 6. Digital (dPCR) Los dispositivos PCR digitales, o dPCR, son los más precisos del mercado. Proporcionan recuentos absolutos del ADN objetivo con mayor sensibilidad, precisión y reproducibilidad. La reacción en cadena de la polimerasa digital está llamada a revolucionar la tecnología del análisis molecular a todos los niveles. Existen dos tipos de máquinas dPCR: PCR digital de gotas (ddPCR): la ddPCR utiliza la polimerasa Taq para amplificar el ADN objetivo en una muestra compleja. Para simplificar el proceso, la ddPCR emulsiona muestras en aceite y utiliza la fluorescencia para procesar y analizar los resultados. Antes del análisis, la muestra se divide en pequeñas gotas y es sometida a un termociclado, para después pasarla por una placa de PCR de 96 pocillos. Este proceso de separación es la principal diferencia entre la ddPCR y la qPCR qdPCR: El proceso de la qdPCR está basado en circuitos fluídicos integrados (chips). Aunque las técnicas basadas en chips tienen un rango dinámico más estrecho, permiten obtener una partición de la muestra extremadamente precisa y una varianza mucho menor. Situadas a la vanguardia de la tecnología de detección, la ddPCR y la qdPCR son máquinas de procesamiento de alta gama con un precio igualmente elevado. Por suerte, se las puede alquilar de forma más asequible. |